In questa sezione introduco un soggetto scandaloso, che spesso rende le notti insonni e porta i tassi di adrenalina a valori prossimi al ricovero… cioè: quanti scatti deve effettuare la fotocamera per poter avere un soggetto completamente a fuoco quando utilizzo un obiettivo da microscopio?
Decine? Centinaia? Quante? Argh!
Non entro nel soggetto dell’ottica e della fisica della luce (anche perché non ne sono in grado), ma almeno un tema per capire come parametrare il nostro sistema lo si deve affrontare, cioè capire cosa significa il Depth of Field (DOF) o, tradotto in lingua madre la “Profondità di campo”.
In parole povere, il DOF corrisponde alla distanza che si trova tra la parte più prossima e la parte più lontana dell’oggetto rispetto all’obiettivo, e che risulta a fuoco. Se ci si allontana oltre (o ci si avvicina all’obiettivo) l’immagine risulterà sfuocata, e sarà quindi necessario spostare l’obiettivo (o il soggetto) per poter visualizzarne altri settori.
Il valore del DOF è funzione dell’apertura numerica dell’obiettivo (NA), dell’ingrandimento (M), del potere risolvente dell’occhio umano, della lunghezza d’onda utilizzata. Alcuni valori (come la lunghezza d’onda ed il potere risolvente) sono costanti, mentre NA ed M sono caratteristiche tecniche dell’obiettivo utilizzato e si trovano spesso indicate sul barilotto, o altrimenti presso il produttore.
L’apertura numerica è il valore che maggiormente influisce sulla DOF, cui è inversamente proporzionale, di modo che ad un valore maggiore di apertura numerica corrisponde un valore inferiore di DOF, e viceversa.
Descrizione generale di un obiettivo; in corsivo è riportata la nomenclatura in inglese. 1- Ghiera (mounting thread); 2- Tipo di correzione sull'aberrazione ottica (Optical Aberation Correction); 3- Ingrandimento (magnification); 4- Apertura numerica (numerical aperture); 5- Distanza (image distance); 6- Distanza di lavoro (working distance); 7- Spessore del vetrino copri oggetto (cover glass thickness); 8- Codice colore relativo al tipo di ingrandimento (magnification color code).
Esiste una formula che generalmente viene utilizzata quando si impiegano obiettivi da microscopia e che è espressa come DOF = 0.00055/(NA*NA) (questa formula ed altre interessanti tabelle sono disponibili sul sito http://zerenesystems.com/cms/stacker/docs/tables/macromicrodof )
Sulla base del valore che si ottiene dalla formula sopracitata, potremo parametrare il movimento del motore e l’avanzamento del sistema di acquisizione. Sarà in funzione della dimensione dell’oggetto che si vuole acquisire che si avrà di un numero di passi maggiore o inferiore; un oggetto relativamente piatto richiederà ovviamente un numero di passi inferiore rispetto ad un soggetto sferico. Si possono considerare i singoli passi come delle lasagne che compongono una bella pasta al forno. Ogni singola fetta di lasagna è un passo, e l’insieme corrisponde a quello che avete nel piatto (mai abbastanza in verità…)
Occorre tenere presente che, al fine di avere tutto il soggetto a fuoco, si deve considerare una sovrapposizione tra passi successivi di un valore variabile tra 20-30%. In questa maniera potremo assicurarci di ottenere un buon risultato finale, a scapito di qualche immagine supplementare (e che non fa mai male). Il processo di fusione dei fotogrammi è effettuato da software specializzati (Helicon Focus e Zerene Stacker sono i più utilizzati), e la parziale sovrapposizione tra immagini successive permette al programma di poter “cucire” le parti insieme dando origine ad un soggetto completo.
Per fare un esempio, ho voluto acquisire un grano di pepe nero, che scorrazzava in dispensa, con tre obiettivi differenti, ma con un ingrandimento approssimativamente analogo, cioè un LOMO 3.7x, un PLAN 4x et un Mitutoyo 2.5x (portato a ~4.7x).
Il risultato delle tre acquisizioni lo si può osservare nella foto seguente.
Sebbene il risultato sia pressoché analogo se si confrontano le tre immagini riportate (non entro nel merito sulla qualità degli obiettivi, magari soggetto di discussione futura) è importante invece paragonare il numero di immagini che sono state necessarie per acquisire l’intera superficie del soggetto (è incluso nel totale un overlap tra passi successivi del 20%):
Mitutoyo “4.7x” NA= 0.14 (DOF di 28µm) 287 immagini
PLAN 4x NA= 0.1 (DOF di 55µm) 155 immagini
LOMO 3.7x NA= 0.11 (DOF di 45.4µm) 158 immagini
Questa differenza, che è anche notevole tra il Mitutoyo “4.7x” e gli altri due obiettivi, è giustificata dal fatto che l’apertura numerica NA del Mitutoyo è di 0.14, mentre il LOMO di 0.1 ed il PLAN 0.11, ed abbiamo visto che ad un valore maggiore di NA corrisponde un valore inferiore di DOF.
Confrontando l’immagine di un fotogramma acquisito con il Mitutoyo (in basso a sinistra) e la medesima immagine acquisita con il LOMO (in basso a destra) si può constatare come il DOF è inferiore nell’obiettivo giapponese, richiedendo quindi un numero maggiore di passi - e di fotogrammi - per coprire l’intero soggetto, rispetto a quello russo. Quest’ultimo possiede un DOF maggiore e, di conseguenza, si ha un numero inferiore di immagini da acquisire. La banda bianca indica approssimativamente la zona in cui l’immagine è accettabilmente nitida.
Concludendo, è importante, prima di lanciarsi in acquisizioni di un numero di fotogrammi scandalosamente elevato (con la conseguenza di occupare Gb di spazio sul vostro disco e tempi smodati di trattamento delle immagini), di conoscere questi semplici parametri.
L’esperienza poi permetterà di affinare la tecnica e di ottimizzare i processi di acquisizione.
Buone acquisizioni!